非梗阻性无精子症（Non-obstructive azoospermia，NOA）是指睾丸生精功能衰竭所致的一类无精子症，约占无精子症患者的60%[1]。引起NOA的原因可能是多方面的，包括47XXY性染色体异常症、 Y染色体显微缺失症、隐睾症、化学疗法、腮腺炎引起的睾丸炎等，还有部分NOA患者病因未明。既往研究发现，睾丸精子发生具有局灶性和不均一性 [2]，而Donoso 等首次通过睾丸取精（testicular sperm aspiration,TESA）在 NOA 患者睾丸中发现精子[3]，这进一步说明，即使睾丸内大部分生精小管中都无法找到精子，仍不能排除其有少量生精灶存在的可能。研究表明，约60%的NOA患者可通过外科手术方式（最常用的就是睾丸取精术）发现精子，并通过辅助生殖技术解决生育问题[4]，但由于其精子产生极少，并不足以随精液排出，常规检查往往无法检测到精子。而常用的睾丸穿刺取精术虽然操作简单，但属于有创检查，通常会给患者造成不同程度的不适感，甚至可能发生阴囊血肿、感染等并发症。因此，在临床工作中，为了减少不必要的有创操作，根据患者实际状况，对其睾丸内部是否存在精子作出一定的预先评估具有重大意义。本研究通过探讨精液细胞学检查对NOA患者睾丸穿刺取精术成功率的预测价值，为NOA患者的无创诊疗提供一定的理论基础。
资料与方法
一、一般资料
回顾性分析2018年至2020年期间于本中心就诊的67例NOA患者作为研究对象，年龄（30.51±4.85）岁。纳入标准：符合非梗阻性无精子症诊断标准；连续2～3次（间隔2周以上复查一次）以上精液离心及沉淀涂片检查均未检出精子；病历资料齐全。排除标准：常染色体异常、Y染色体存在微缺失、梗阻性无精子症患者；逆行射精者；不射精者；合并急性附睾炎、睾丸炎、精索炎、精囊炎、前列腺炎及阴囊皮肤感染患者；合并结核、梅毒等传染病者；两侧睾丸体积均<10 ml者；全身恶性肿瘤及凝血功能异常。
二、研究方法
（一）精液细胞学检查
患者禁欲2-7天后，手淫法采集其精液标本，置于37℃恒温水浴箱内，待充分液化后离心，沉淀物以磷酸缓冲液（pH=7.2）洗涤3次后涂片（每个标本制作3张涂片），待自然风干后，以95%乙醇固定1 min，以洗瓶冲洗干净后，伊红染色3 min, 以流水冲洗后，亚甲基蓝染色2 min，以流水冲洗干净后，再次晾干。（10×100）油镜下观察是否存在处于不同发育阶段的生精细胞。根据检测结果，将患者分为甲组（发现处于不同发育阶段的生精细胞）和乙组（未发现处于不同发育阶段的生精细胞）。
（二）睾丸穿刺取精
患者取仰卧位, 常规消毒阴囊皮肤，用2%利多卡因实施局部麻醉后，以拇指、食指和中指固定睾丸，用22 G空针头穿刺睾丸并吸取少许睾丸组织，以G-MOPSTM[3-（N-吗啉）丙磺酸]（购于Vitrolife）冲洗3次后，充分研磨使生精细胞溢出，立即取样制作湿片（每个标本制作3张涂片）。（×100）相差显微镜下观察是否存在精子。
（三）统计分析方法
使用SPSS 20.0对数据作统计分析。本研究所涉及的甲组和乙组为两组独立样本，资料类型为计数资料，可以整理为独立样本四格表资料，根据理论频数的实际情况选择Pearson卡方、连续性校正的卡方或Fisher’s检验。对检验结果的解读：P > 0.05视为差异无统计学意义；P< 0.05判定差异显著，P< 0.01判定差异极显著，此二者结果均具有统计学意义。
结果
一、精液细胞学检查结果
根据精液细胞学检查结果，67例NOA患者，其中36例患者的精液中可以发现处于不同发育阶段的生精细胞（设为甲组），另外31例未见任何类型的生精细胞（设为乙组）。经统计两组患者在年龄、睾丸体积大小（≥10 ml）等方面无统计学差异。
二、睾丸穿刺取精结果
根据睾丸穿刺取精结果，如表1示，甲组36例患者穿刺后找到精子的有23例，乙组31例患者穿刺后找到精子的有11例。甲组患者睾丸穿刺取精术成功率显著高于乙组患者（P <0.05）。
表1两组患者睾丸穿刺检测结果
病例 病例数 穿刺后有精子 穿刺一致率
有各级生精细胞 36 23 63.89%
无各级生精细胞 31 11 35.49%
P值 0.020（< 0.05）
三、取精后辅助生殖结果
结果如表2示，其中有各级精原细胞及精子细胞穿刺查找精子的23例患者中16例进入ICSI助孕治疗，经过1-2个周期治疗后14例成功怀孕并成功生产。未查见各级生精细胞而查找精子的11例患者中6例进入ICSI助孕治疗，经过1-2个周期治疗后14例成功怀孕并成功生产。两者进入辅助生殖周期后在妊娠结局方面比较差异无统计学意义，与现有资料显示一致。
表2组患者睾丸穿刺取精助孕结局
病例 病例数 穿刺后有精子 进入ICSI例数 1-2周期成功数
有各级生精细胞 36 23 16 14
无各级生精细胞 31 11 6 6
P值 > 0.05
讨论
男性不育症是当今生殖医学常见疾病，严重影响男性身心健康和家庭和谐。世界卫生组织调查表明，15%的育龄夫妇存在不孕不育问题，而男性不育占50%[5]。随着辅助生殖技术发展日趋成熟，少弱畸精症等患者多可借助辅助生殖技术实现孕育属于自己的后代。而无精症成为男性不育难中之难，卵母细胞单精子显微注射（ICSI）技术的发展使得一部分无精症患者获得了拥有自己后代的机会[6-8] 。因此，在临床工作中如何在无精症患者的睾丸中找到精子成为最大的挑战。无精症分为梗阻性无精症（OA）和非梗阻性无精症（NOA）。其中NOA患者发病主要是因为睾丸大部分或全部生精小管发生阻滞，致使生精细胞发育停滞于生精过程的某一阶段，造成精液中无精子出现。研究指出，由于NOA患者睾丸精子产生具有不均一性和局限性，在部分患者的生精功能衰竭的睾丸中仍有少量成熟精子在睾丸生精小管中储存，通过外科手术以及辅助生殖技术，能够帮助NOA患者得到有自己血缘的后代[9-10]。其中临床最常用手术方式的就是睾丸穿刺取精术（TESA），TESA取精成功率不同中心报道不一，不可否认的是不同状况的患者取精成功率是不一致的[11-12]，并且TESA作为一种有创检查本身可能给患者造成一定的创伤，因此对TESA指征的判断至关重要（）。既往研究[13]表明，NOA患者的睾丸体积、FSH水平均对其睾丸中有无精子有一定预测作用，且睾丸体积的预测准确性高于FSH水平。但无论是睾丸体积还是FSH水平，其作为评估指标都具有一定的局限性。本研究回顾性分析了2019年至2020年期间于陆军特色医学中心生殖医学中心就诊并行TESA取精的67例非梗阻性无精子症患者作为研究对象，试图探讨精液细胞学检查对非梗阻性无精子症患者睾丸穿刺取精术成功率的实际预测价值，为TESA指征的评估提供参考。
精液的主要成分是精子和精浆，其中精浆是属于性腺的分泌物，约占90%～95%，精子及各种细胞成分约占5～10%[14-15]。由于精子生成过程中曲细精管的同一转化部位可以同时存在多个精子成熟阶段。所以精液内含有的细胞成分中可有生精细胞，其主要由精原细胞、精母细胞和精子细胞等组成、可伴随着成熟的精子进入精液中[16-17]。通过应用光学显微镜辨认及离心沉淀、染色后的精液细胞，着重从未成熟生精细胞的形态、比例、分化程度来判断睾丸内是否具有残存的精子生成能力[18-19]，是近年来开展的一种无创伤、无后遗症、作简便的判断精道梗阻与否及睾丸生精功能的检测方法。非梗阻性无精症患者睾丸中无成熟的精子，只有不同类型 、不同比例的未成熟生精细胞或支持细胞 ，说明无精症是由睾丸生精功能障碍引起 ，而不是由输精管道梗阻所致 ，其输精管道通畅 ，考虑为非梗阻性无精症[20] 。从本次研究结果分析来看，甲组患者睾丸穿刺取精术成功率显著高于乙组患者（P< 0.05），提示精液细胞学检查发现存在不同发育阶段的生精细胞对NOA患者睾丸中是否存在精子具有一定的预测作用。但两组取得精子的病例在辅助生殖技术中的结局没有差异性，与相关资料的结论一致。由于本次研究为回顾性分析具有一定的局限性，该结论尚需进一步验证。此外，部分NOA患者可能存在多次TESA结果不一致的情况，即使其睾丸内部存在精子，TESA也有一定的失败概率，这也在一定程度上影响了研究结果的准确性。总之，临床工作中对NOA患者睾丸中有无精子的评估需要综合考虑各种因素，最大程度地避免不必要的TESA。
