复发性流产（RM）及反复种植失败(RIF)一直是生殖领域的难点及热点问题，子宫内膜微生态为该领域的研究提供了新的方向。
本期文献解读邀请香港大学深圳医院刘庆芝主任解读Uterine microbiota plasticity during the menstrual cycle: Differences between healthy controls and patients with recurrent miscarriage or implantation failure（中文译名：健康人群与复发性流产、反复种植失败患者子宫内膜菌群在月经周期期间的差异），该篇文献由 Vomstein K等发表在Journal of Reproductive Immunology（IF：3.993）中。
这项前瞻性研究发现子宫内膜菌群组成在健康对照和RIF以及RM患者在月经周期期间总体微生物组成的存在差异，患者组中较高的α多样性和较低的乳酸杆菌科丰度表明微环境发生了变化，这可能使患者更容易发生妊娠失败。
专家介绍
刘庆芝 教授
香港大学深圳医院生殖医学科
顾问医生 主任医师
反复流产及生殖免疫专科学科带头人
深圳市健康管理协会生殖健康多学科（MTD）分会会长
深圳女医师协会风湿免疫专委会副主任委员
深圳市医师学会妇产科医师分会理事
深圳市医师学会妇女保健专业委员会常委
广东省医师协会协会生殖医学专委会委员
广东省健康管理学会妇产科及生殖内分泌专业委员会委员
中国妇幼健康研究会生殖免疫学专业委员会委员
德国弗莱堡医学院妇产科访问学者
研究背景
近年来，测序技术证实子宫腔中存在微生物，与阴道菌群相似，子宫内膜菌群通常以乳酸杆菌属为主。2016年Moreno等人在子宫内膜液样本中除乳酸杆菌属之外检测到其他属，包括双歧杆菌属、加德纳菌属、普雷沃菌属和链球菌属等。2020年Carosso等人在15例ART患者子宫内膜活检中发现超过90个细菌属：其中乳酸杆菌属占优势，另外存在低丰度的加德纳菌属、普雷沃菌属和丙酸杆菌属。2022年Moreno 等通过对342例不孕患者的子宫内膜液和活组织检查的研究而得出，不良生殖结局患者中存在奇异菌属、双歧杆菌属、金黄杆菌属、加德纳菌属、嗜血杆菌属、克雷伯氏菌属、奈瑟氏菌属、葡萄球菌属和链球菌属相比，活产的患者中乳酸杆菌属占有优势。
然而，2020年Riganelli 等人在34名ART患者中发现子宫内膜菌群中，乳酸杆菌属仅少量存在，而德昌库克菌、少动鞘氨醇单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、根癌土壤杆菌、杜氏代尔夫特菌和痤疮角质杆菌更丰富。类似的， 2019年Winters等人在25名由于子宫肌瘤而经历子宫切除术的意大利患者（40岁以上）的子宫样本发现子宫内膜菌群中不动杆菌属、梭菌属、丛毛单胞菌科和假单胞菌属占主导地位。但必须注意的是，这些细菌中的一些是16S分析中已知的污染物，这强调了在低生物量样本如子宫内膜中实验设计的重要性。除了乳酸之外，乳酸杆菌产生细菌素和过氧化氢，其有助于抑制病原体并促进胚胎植入的支持性环境(Petrova et al., 2015) 。
因此，乳酸杆菌属主导的（乳酸杆菌属> 90%）子宫内膜菌群与生殖成功相关。然而，子宫内膜中非乳酸杆菌属主导的菌群如加德纳菌属和链球菌的存在似乎与着床、持续妊娠率和活产率的显著降低相关(Moreno et al., 2016) 。妊娠期间阴道和子宫内膜菌群组成的改变通常与炎症有关，这可能导致妊娠并发症，如早产、妊娠丢失甚至不孕症(Fox and Eichelberger, 2015) 。
持续无子女的夫妇包括复发性流产(RM)患者和反复种植失败(RIF)患者。复发性流产（RM）由世界卫生组织（WHO）定义为在妊娠20周之前≥ 3次妊娠丢失，在育龄妇女中发病率约为1-3%。反复种植失败（RIF）的患病率在接受辅助生殖治疗（ART）的夫妇中约为10%。RM和RIF仍是辅助生殖领域难以解决的难题。
研究目的
本研究的目的是纵向研究月经周期中子宫内膜菌群是否存在变化，以及患有RM或RIF的女性子宫菌群与健康对照相比，是否存在差异。
研究方法
本前瞻性研究共纳入20例RM患者、20例RIF患者和10例健康对照患者。在每例受试者中，在卵泡期、排卵期和黄体期进行子宫冲洗。分离细菌DNA并进行V3-V4区的16S扩增子测序分析。在月经周期的每个时间点和随时间推移，分别比较来自疾病组和对照组样本之间的微生物多样性。
研究流程
注：所有患者和对照组均具有规律的月经周期（27-29天）。
研究结果
月经周期与子宫内膜组成
图1.子宫内膜冲洗液中微生物多样性分析
通过月经周期过程中Shannon-（A）和Chao1（B）指数的个体内变化分析α多样性
首先，研究人员评估了健康对照和RIF以及RM患者在月经周期期间总体微生物组组成的差异。
与疾病组不同，在健康对照组中，Shannon指数在卵泡期和排卵期前后显示出受试者内显著降低，在黄体期保持在较低水平，表明子宫内膜微生物群的复杂性较低。
使用Chao1多样性指，检测到RIF患者排卵期和黄体期与卵泡期相比不同细菌分类群数量显著增加；与对照组相比，RIF和RM的α-多样性内的方差要高得多。
图1C. 使用未加权Unifrac距离的多维标度（MDS）进行β-多样性分析
根据月经周期的不同阶段和各自的临床亚组(对照组、RIF组、RM组)比较微生物群组成。未加权Unifrac距离的多维标度（MDS）揭示了时间点和亚组与不同群落组成的显著相关性，尽管效应值相当小。
组内微生物类群的纵向丰度
为了更好地定义月经周期中发生的分类学变化，使用负二项模型，并比较了月经周期中三个采样时间点之间每个亚组(对照组、RM和RIF)的分类学分布。
图2A. 门水平上，在月经周期中比较对照、RIF和RM组之间的菌群组成
在门水平上，健康对照组的微生物群特征为卵泡期厚壁菌门丰富（平均丰富度46.15%），在月经周期中有进一步增加的趋势。厚壁菌门包括杆菌纲中包含乳酸杆菌科。变形菌门在卵泡期也很容易检测到，但在排卵前后和黄体期减少（卵泡期平均丰度为46.96%，排卵前后为26.11%，黄体期为13.3%）。比较卵泡期和黄体期时，差异显著（p = 0.013）。
在RM组中，厚壁菌门(主要是乳酸杆菌科)随着时间的推移也有类似的显著增加(40.44% vs . 62.45% vs . 59.64%)。在卵泡期与排卵期和黄体期比较时，这是显著的(p < 0.01)。
在RIF组中，月经周期期间没有明显的趋势，整个采样期间变形菌门的丰度较高，但厚壁菌门的丰度较低（变形菌的平均丰度范围为31.96%-45.31%，厚壁菌门的平均丰度范围为38.39%-51.73%）
图2B. 纲水平上，在月经周期中比较对照、RIF和RM组之间的菌群组成
在纲水平上，RIF组在黄期体与排卵期比较时芽孢杆菌纲具有显著性差异(图2B)(平均丰度为36.18%和48.20%，p < 0.01)。
图2C. 在科水平，在月经周期中比较对照、RIF和RM组之间的菌群组成
图2D. 在属水平，在月经周期中比较对照、RIF和RM组之间的菌群组成
在科(图2C)和属(图2D)的水平上检查分类组成，与对照组和RM组不同，RIF组表现出显著的多样性组成。
RM和RIF之间菌群丰度的差异
图3. 疾病组[A]和月经周期[B]之间差异丰富的菌群比较
标准化为对照组丰度（A）和卵泡期丰度（B）的丰度热图。
研究人员使用负二项模型将RM和RIF组在月经周期的每个采样时间点的分类组成与对照组进行比较。
在RIF患者中，在门水平上，检测到在周期的排卵期和黄体期厚壁菌门的丰度降低（p < 0.01）。与此同时，黄体期的变形菌门增多（p＜0.01）。
RM组在月经周期结束时变形杆菌的增多也很明显（p＜0.05）。在RIF组卵泡期检测到最高数量的拟杆菌（平均丰度5.83%），与对照组相比，RM和RIF中放线菌的频率更高。
在较低的分类水平上，对照组中属于乳酸杆菌目的细菌丰度明显较高（相对丰度范围为33.46% ~ 76.84%）。与对照组相比，在RIF中，加德纳菌属和小杆菌属等在排卵前后升高。
研究结论
本研究提供了健康对照组子宫内膜菌群组成的纵向、周期依赖性变化的数据。这些变化在RIF和RM患者中均不存在。
两个患者组中较高的α多样性和较低的乳酸杆菌科丰度表明微环境发生了变化，这可能使患者更容易发生妊娠失败。
女性生殖周期中的微生物可塑性现象以及在生殖失败患者中观察到的变化表明，子宫菌群可能有助于形成支持胚胎着床和维持的环境。
专家点评
近年来随着生殖医学快速发展，反复流产及反复种植失败也一直是生殖领域的难点及热点问题，子宫内膜微生态的研究为这个领域打开另一个视角的研究。2022年6月发表在Journal of Reproductive Immunology（IF: 3.993）的一项前瞻性队列研究，利用16S rRNA基因测序技术研究了月经周期中子宫菌群是否存在变化，以及患有RM或RIF的女性子宫菌群与健康对照相比，是否存在差异。
这个研究发现子宫内膜菌群组成在健康对照和RIF以及RM患者在月经周期期间总体微生物组成的存在差异，前者黄体期子宫内膜微生物群的复杂性较低；而RIF和RM患者排卵期和黄体期与卵泡期相比不同细菌分类群数量显著增加。
另外，健康对照组的微生物群特征为卵泡期厚壁菌门丰富（主要是乳酸杆菌科），在月经周期中有进一步增加的趋势，RM厚壁菌门随着时间的推移也有显著增加，RIF厚壁菌门的丰度较低，变形菌门的加德纳菌属和小杆菌属等的丰度较高。
由此可见，多样性和较低的乳酸杆菌科丰度表明RIF患者子宫内膜微环境发生了变化，这可能使患者更容易发生妊娠失败原因之一。
用循证医学视角，如何改善宫腔环境，提高患者宫腔乳酸杆菌科丰度，个体化药物治疗来提高RIF患者妊娠成功率，需进一步研究。
