钙调素(RGN)蛋白在细胞内钙离子信号传导，调节物质代谢、细胞核功能、基因表达及抑制细胞增殖、凋亡中起着重要作用，关于其在肝纤维化中是否发挥一定的功能，目前研究较少。本研究以猪血清大鼠腹腔内注射建立免疫性肝纤维化模型，选用具有抗肝纤维化作用的药物谷胱甘肽复方注射液(CGII)进行干预治疗，观察其对免疫性肝纤维化大鼠及其RGN的影响，进一步探讨其抗纤维化的分子生物学机制。

 01  材料与方法 

　　1.实验动物：Wistar大鼠，SPF级，雄性，体质量(225±25)g，购于中国医学科学院实验动物研究所繁育厂;SPF级鼠饲料，动物饲料生产许可证号：SCXK(渝)2007-0006。

　　2.试剂及仪器：猪血清系北京燕生政博生物科技有限责任公司出品;RGN引物购自北京鼎国生物技术有限责任公司;逆转录试剂盒及预染蛋白质相对分子质量购自加拿大。其他试剂包括BCA蛋白定量试剂盒、SYBR
Green和RNA纯化试剂盒、Trizol试剂等。

　　3.免疫性肝纤维化大鼠模型的建立：Wistar大鼠共164只适应性喂养后，随机分为正常组、造模组。正常组大鼠给予等渗盐水腹腔注射0.5ml/只，造模组予无菌猪血清0.5ml/只腹腔注射，每周2次，连续8周，对造模大鼠4只并行病理学检查，病理改变均符合大鼠免疫性肝纤维化病理诊断标准的3~4级病理组织学改变。

　　4.RT-PCR检测肝组织中regucalcin
mRNA的表达：采用标准的Trizol-酚-氯仿法提取总RNA，经纯化后采用紫外分光光度法测定RNA在波长为260nm和280nm时的吸光度值(A260、A280)，以A260/A280的比值鉴定RNA的纯度。(在1.60~1.80方可)并记录浓度。

　　5.免疫组织化学：采用EnVision二步法，切片常规脱蜡，高压锅抗原热修复，滴加第一抗体(1:200)，4℃过夜，滴加第二抗体，DAB显色，苏木精复染。结果判定：光镜下观察，肝细胞胞质染成棕黄色为阳性。每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，计数100个细胞中的阳性细胞占比。

　　▲各组大鼠肝组织Masson染色结果 ×200

 02  结 果 

　　1.RGN对猪血清致免疫性肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响：自然恢复组大鼠肝组织汇管区纤维结缔组织呈条索状向肝实质延伸形成纤维间隔，但尚未完全包饶正常肝组织形成假小叶，纤维化程度与模型组差异无统计学意义。CGII干预组比纤维化组及自然恢复组中肝组织胶原减少、变细，部分向肝小叶延伸，纤维化程度明显改善。

　　▲各组大鼠肝组织HE染色结果 ×40

　　2.实时荧光定量RT-PCR检测大鼠肝组织RGN mRNA的表达：和正常组相比，纤维化组RGN
mRNA表达明显降低，P值均<0.01，差异具有统计学意义;自然恢复组与模型组比较，有少量增加，但差异无统计学意义。

　　3.免疫组织化学法检测大鼠肝组织RGN蛋白的表达：正常组大鼠肝组织RGN蛋白表达广泛，主要见于肝间质细胞及肝实质细胞内，细胞核有部分表达。与正常组比较，纤维化组中RGN表达量明显减少;自然恢复组比模型组有少量增加，但差异无统计学意义。

　　▲各组大鼠肝组织RGN的免疫组化染色 ×400

 03  讨 论 

　　RGN是1978年Yamaguchi发现的一种高度保守的亲水性蛋白质，正常生理情况下，RGN
mRNA主要于大鼠肾皮质细胞和肝脏细胞中大量表达，在大鼠骨骼、心脏、脑以及其他组织细胞中也有少量表达。研究表明，RGN参与了某些疾病的发生、发展过程。

　　目前在肝纤维化的发病中，RGN的作用关系鲜有报道，课题组通过成功建立血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化模型，选用具有抗肝纤维化作用药物CGII进行干预，干预后随着纤维化程度的减轻，与纤维化组比较肝组织中RGN
mRNA及蛋白的表达明显增加，结合试验结果，推测在肝纤维化发病过程中RGN可能具有较为重要的意义。

　　研究表明，通过免疫组化显示正常组大鼠肝组织RGN蛋白与肝实质、间质细胞及细胞核均有表达，猪血清诱导的大鼠肝纤维化模型肝组织RGN蛋白表达均下降，且仅肝细胞胞质表达。

　　综上所述，考虑CGII可能通过上调RGN蛋白表达，减少钙离子过度内流，抑制蛋白激酶C活性，降低TGF-β1及PDGF的蛋白表达，减少HSC活化;从而发挥其抗肝纤维化作用。由于本实验仅观察了免疫性肝纤维化大鼠中RGN蛋白的表达及CGII对其影响，需进一步通过多种肝纤维化模型及其他药物进行验证。