颅内静脉系统血栓形成 (cerebralvenousthrombo- sis, CVST)包括脑静脉空窦及脑静脉血栓形成 (venous thromboembolism, VTE), 是一种少见的缺血性脑血管 病 ,占全部脑血栓形成的 3.5%, 占脑卒中的 0.5% ～ 2.0%[ 1] 。临床和影像学表现缺乏特异性 ,病因 、发病 机制复杂多样 , 早期诊断困难 , 病死率高达 30% ～ 50%。近年来 , 遗传学研究成为热点 , 抗凝血酶 -Ⅲ (antithrombin, AT-Ⅲ )基因缺陷是最早发现的 VTE遗 传性危险因素 , 我们利用变性高效液相色谱 (denatu- ringhighperformanceliquidchromatography, DHPLC)技 术 ,对 50例生育期女性 CVST患者的 AT-Ⅲ基因各扩 增片段的 PCR产物进行筛查 ,探讨 AT-Ⅲ基因突变及 多态性与该人群 CVST的相关性 。 1 资料与方法 1.1 一般资料 收集 2006年 6月至 2007年 12月南 方医科大学南方医院生育期女性 CVST就诊患者 50例 及严格配伍的健康女性 52例外周静脉血 。 CVST(符 合第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准 )均经彩 色多普勒 、CT、MRI、静脉造影等证实 。 病例组入选标 准 :年龄 18 ～ 50岁 ;抽血前 2周以上均未使用抗凝药 物 。受试者排除标准 :伴有严重糖尿病 、肝肾疾病 、自 身免疫性疾病及 DIC等明显引起 AT-Ⅲ活性改变的 疾病 。均为散发病例 , 6例有 CVST既往史目前健康的 生育期女性 , 44例为 CVST现患患者 。

1.2 方法 1.2.1 标本采集与 DNA提取 在获得所有受试者知情同意的原则下 ,采集空腹外周静脉血液 1.8 mL,加 入 0.2 mL0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝 ,立即 4℃、3 000 r/min离心 10min, 分离乏血小板血浆 ,收集上层液 (黄 色 ), 1个月内分别采用 ELISA法 、发色底物法检测 AT -Ⅲ抗原含量 (AT-Ⅲ :Ag)和 AT-Ⅲ活性 (AT-Ⅲ : A)。 2周内采用酚 /氯仿提取法提取基因组 DNA,核酸 蛋白分析仪 (eppendorfbiophotometer)检测样本 DNA 纯度和浓度后于 -20℃冰箱保存 ,备用 。 1.2.2 PCR扩增 针对 AT-Ⅲ基因的启动子区 ,第 1、2、3A、3B、4、5、6外显子及其侧翼区设计 10对 PCR 引物 (其中外显子 2、4各拆分为 a、b两片段 ),由上海 英骏生物技术有限公司合成 。引物序列 、扩增片断长 度及 DHPLC检测柱温 ,见文献 [ 2] 。 PCR扩增在 ABI 9700 PCR仪上进行 。 50 μLPCR反应体系含 :10 × PCR缓冲液 5 μL, 2.5 mmol/LdNTP4 μL,上 、下游引 物各 10 pmol, PfuDNA聚合酶 1 U,基因组 DNA100 ng。采用降落 (TouchDown)PCR方法 , 10个片断的反 应条件 ,启动子区为 :95℃预变性 5 min;接 94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 30 s, 15 个循环 , 退火温度每循环降 0.5℃,至 51℃;然后 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 20个循环 ;最后 72℃延伸 7 min。其余 9个片段的退 火温度不同 , 余项同 。 PCR反应结束后 ,取 5 μL扩增 产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳 , 观察 PCR产物的特 异性和片断大小 。 1.2.3 DHPLC分析 用 DHPLC分析仪 (WAVEDNA fragmentanalysissystem, Transgenomic, US)对 10 种 PCR扩增片断进行分析 。使用 Transgenomic公司 Navi- gator软件包和斯坦福大学提供的 DHPLCMeltProgram 对 AT-Ⅲ基因 (http://insertion.stan-ford.edu/melt.html)各扩增片段的检测温度和分离梯度进行预测 。 除外显子 4a用两个检测温度外 ,其余扩增片段均用 1 个检测温度进行 DHPLC筛查 。各片断的最佳柱温见 文献 [ 2] 。 每次进样量为 5 μL,在相应的柱温下 , 异源双链 和同源双链先后从 DNA色谱柱 (DNASep, Transgenom- ic)中分离出 来 。洗 脱液包括 缓冲液 A(0.1 mol/L TEAA)和缓冲液 B(0.1 mol/LTEAA, 25%乙腈 )。如 待测样本的洗脱峰为单峰时 , 将待测样本与经测序证 实的野生纯合型 PCR产物按 1∶1的体积比混合 , 在 PCR仪上进行变性 -复性处理 , 即 95℃变性 5 min,然 后以 1℃/min的速度降至 45℃,使变异纯合子的 PCR 产物充分形成异源双链 ,再经 DHPLC仪分析 。 1.2.4 DNA序列分析 经 DHPLC分析 , 筛选出有异 源双链峰型 (数目和形态异常 )的样品 ,再次 PCR扩增 相应片段后 , 用 QIAGENQIAquickGelExtractionKit 试剂盒纯化回收 DNA片段 。将纯化的 DNA片段送上 海英骏生物技术有限公司进行双向测序 ,测序结果采 用 DNAstar软件与 GenBankAT-Ⅲ基因参考序列进行 比对分析 。 1.3 统计学方法 所有统计数据均用 SPSS13.0统计软件分析 。样本间计量资料的均数比较采用单因素 方差分析 (one-wayANOVA),样本间率或基因型的构 成比较采用 R×C表资料的 2 检验 。 2 结果 2.1 生化检验 病例组及对照组 AT蛋白的实验室检 测 结 果 :两 组 AT-Ⅲ 抗 原 含 量 水 平 , 病 例 组 为 (213.982 ±59.552 )mg/L, 明 显 低 于 对 照 组 的 (295.189 ±46.221)mg/L。 F=59.454, P<0.001,说 明组间差异有统计学意义 ,可认为不同组间 AT-Ⅲ抗 原含量水平不同 。两组 AT-Ⅲ血浆活性水平 ,病例组 平均 为 (59.518 ±9.290 )%, 明 显 低 于 对 照 组 的 (93.302 ±12.157)%。 F=247.255, P<0.001,说明组 间差异有统计学意义 ,可认为不同组间 AT-Ⅲ血浆活 性水平不同 。 2.2 DHPLC筛查 应用 DHPLC分析所有受试者 AT -Ⅲ基因各扩增片段的 PCR产物后 , 6种异常峰形 (4 种双峰 , 2种三峰 ),在 102例标本的各 10个扩增片段 中共有 67个片段出现异常峰型 ,而在 2个野生型样品 各 10个扩增片段中亦有 54个片段出现 4种异型峰 。2.3 DNA序列分析结果 每一种异常峰型的标本均 进行直接双向测序 。测序结果与 GenBankAT-Ⅲ基 因参考序列比对分析 , 发现这些序列变异均为单个碱 基的置换 ,未发现单碱基或小片段的缺失及插入 。其 中 ,发现突变位点 1个 , 为已报道的致病突变 :Intron1 5+5 G>A突变 , SNP位点 5个 ,其中 4个为 SNP库 已报道的 SNP位点 (包括 2种 Exon4上的 cSNP,分别 是 c327 GTA※GTG(Val)及 c337 CAA※CAG(Glu);另 2个位于内含子 ,分别是 Intron4 -53 G>A, Intron5, +27 G/C), 1个为新发现的 SNP位点 ,位于内含子 In- tron3A +50 G>A。对照组亦发现 4个为 SNP库已报 道的 SNP位点 。测序结果与 DHPLC峰型一致见图 1 ～ 3。多态性位点中 ,外显子 4 +219 GTA>GTG及 + 249 CAA>CAG,内含子 5 +27 G>C,三处多态性发生 频率较高 ,且病例组和对照组中均同时发现 ,组间比较 差异无统计学意义 (P=0.806、0.832、0.709)。而 SNP 库已报道的 Intron4 -53 G>A,在两组均发现 ,病例组 11例 ,对照组中仅发现 1例 , 组间比较差异有统计学 意义 ( 2 =7.850, P=0.005)。见表 1。致病突变 1例 Intron1 5+5 G>A及新发现的 2 例 SNP位 点 In- tron3A +50 G>A均发现于病例组 ,对照组中未发现 , 因发生例数小于 5未进行统计学分析 。2.4 等位基因频率的计算和 Hardy-Weinberg平衡的 判定 取病例组和对照组 AT-Ⅲ基因多态性无差异 的 3个 SNP位点进行 Hardy-Weinberg平衡检验 ,病例 总数为各组病例数之和 102例 。根据样品的基因型频 率分布计算等位基因频率 [按 (p+q)2 =p2 + 2pq+q2 =1来计 算各个等位基 因的频率 :P=(2 ×p2 + 2pq)/102;q=(2 ×q2 +2pq)/102] ,进一步计算出受试 者中这 3个 SNP位点的各基因型频率的预期值 , 用 R ×C表 2 检验方法分析 ,结果 P>0.05,表示预期值和 观察值之间的差异无统计学意义 ,可认为所选人群 AT -Ⅲ基因的等位基因频率和基因型频率分布符合 Har- dy-Weinberg平衡 。 3 讨论1965年 EGEBERG[ 3] 首次报道先天性 AT缺陷症 是遗传性 VTE的危险因素 ,是一种常染色体显性遗传 病 。 AT-Ⅲ基因 SERPINC1(基因库 X68793.1, MIM# 107300)位于 1q23 ～ 25, 全长 13.9 kb, 有 7个外显子 和 6个内含子 。 AT-Ⅲ编码一种由 432个氨基酸组成 的单链糖蛋白 , 相对分子质量为 58.2 ku,该蛋白是丝 氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一 。自 1993年 LANE 等[ 4]报道 AT基因全序列以来 , 目前发现的引起遗传 性 AT缺陷症 (分为 Ⅰ型和 Ⅱ型 )的 AT基因突变达 180 余种 。 AT-Ⅲ 缺乏 在 正常 人 群 中约 占 0.02% ～ 0.17%,在家族性 VTE患者中约占 4% ～ 7%。 AT-Ⅲ 是机体内最重要的抗凝血物质 ,主要抑制凝血酶的活 性 ,占血浆中全部抗凝活性的 70% ～ 80%, 在肝素的 作用下抗凝活性增强 1 000 ～ 3 500 倍[ 5] 。 AT通过 Arg393 ～ ser394的丝氨酸蛋白酶反应点及 Lys残基和 Arg残基二个功能位点 , 与肝素 、凝血酶结合 , 发挥其 抗凝作用 。近年来 ,国内对先天性 AT缺陷症的报道 逐渐增加 ,但仍没有流行病学方面的资料 。 DHPLC是近年发展起来的一种高通量 、快速 、准 确的 DNA片段突变和多态性筛查方法 。 我们利用 DHPLC这一技术平台筛查所有受试者 AT-Ⅲ基因的 所有扩增片段 ,结果发现 1例已报道的致病突变 ,为内 含子 1, 5′端 +5位点 G>A突变 ,该患者无 VTE既往 史及家族史 。其 AT蛋白实验室检测结果 :AT:Ag和 AT:A分别为 165 mg/L和 25.8%, AT:Ag为参考值的 50%左右 , AT:A为参考值的 50%以下 ,为 Ⅰ型抗凝血 酶缺陷 。 LILIANE[ 6]报道了一下肢深静脉血栓形成 (DVT)患者 ,内含子 1, +5位点 G>A突变 ,符合 Ⅰ型遗传性 AT缺陷症的特征 ,是导致先证者血栓形成的 原因 。在脊椎动物基因 5′端剪接供体位点 , +5处 G 是高度保守的 [ 7 -8] ,此区的 G碱基置换可导致 U1 SnR- NA互补区剪接位点的碱基对稳定性明显下降 。由此 我们推测该患者内含子 1, +5位点 G>A突变 , 可能 产生异常不稳定的 mRNA,容易被破坏 ,失去合成正常 AT-Ⅲ的功能 ,从而导致 CVST。人类约 60%的基因 有可变的表达模式 , 约 80%的选择性剪接事件会改变 蛋白质序列 。作用于剪接的突变通常是有害的 , 人类 的致病点突变中 , 有 15%是由不正常剪接引起的 。可 变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要 机制 , 是导致人类基因和蛋白质数量较大差异的重要 原因[ 9] 。绝大多数已知的影响剪接的遗传缺陷是在 5′ 和 3′端高度保守的剪接位点 AG/GT上单碱基的置换 , 形成了一个新的裂解信号 ,影响正常位点的剪接 ,产生 异常 mRNA。根据 AT数据库 ,引起 AT缺陷的所有变 异中大约 8%发生在剪接位点[ 10] 。 本研究新发现的 1个 SNP位点是 Intron3A +50 G >A,发生于病例组 ,正常对照组中无发生 。因发生例 数小于 5,未进行统计学分析 。而 SNP库已报道的 In- tron4 -53 G>A,在两组均发现 ,病例组 11例 ,对照组 中仅发现 1例 , 组间 比较差异有统计 学意义 ( 2 = 7.850, P=0.005)。推测这两个 SNP位点可能是一种 有功能的 SNP位点 ,影响了 AT-Ⅲ mRNA的表达 ,从 而影响 AT-Ⅲ蛋白的表达量 ,进一步影响其生物学活 性 ,导致 AT-Ⅲ活性降低 ,诱发 CVST, 需加大样本量 或进一步的 mRNA表达水平或蛋白功能分析等以明 确 。 SNP在单个基因或整个基因组中的分布不均匀 , 绝大多数 SNPs位于非编码区 。过去这些位于非编码 区的 SNPs被认为是无功能的变异 ,但目前的研究表明 这些 SNPs也可能会影响 mRNA的转录水平 ,导致蛋白 活性改变 。 RIEDER等[ 11]的研究提示位于 VKORC1基 因非翻译区的 5个 SNPs与该基因 mRNA的表达水平 相关 ,从而对华法林用量的个体差异产生影响 。 外显子 4 +219 GTA>GTG及 +249 CAA>CAG, 内含子 5 +27 G>C, 3 个 SNP位点发生频率较高 (22% ～ 42%), 组 间比较差 异无统计 学意义 (P> 0.05)。说明这 3个 SNP位点可能是无功能的 SNP位 点 ,不改变氨基酸的序列或影响 AT-Ⅲ mRNA的表 达 。因此 ,推测携带这些无功能的 SNP位点的患者 ,其 发病可能与其他遗传缺陷和 (或 )环境因素有关 。虽然我们检测的病例组中大多数 (约 70%)没发 现有意义的突变或 SNP位点 ,但患者的临床表型也可 能因基因修饰所致 ,如可调控染色质结构和基因表达 方式的遗传性变化而不涉及 DNA序列改变的表观遗 传学 (epigen- etics)修饰 。其涉及的机制包括 DNA 甲基化 、组蛋白修饰 、染色质重塑及非编码 RNA调控 等 。基于此 , VTE患者也不排除这些表观遗传学方面 的改变 ,须进一步行体外表达等功能分析以证实 。 AT-Ⅲ基因突变可能是导致生育期女性 CVST的 遗传因素之一 ,功能性 SNP位点也可能参与了该人群 CVST的发生 。