作者：石雪迎（通信作者），郑杰（北京大学医学部病理学系北京大学第三医院病理科）
来源：中华病理学杂志
结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，在我国，特别是在现代化发展迅速的大都市里，结直肠癌发病率的上升趋势更为明显。染色体不稳定（chromosomal instability，CIN）途径和微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）途径是结直肠癌发生的两条主要分子途径。前者占散发性结直肠癌的75％，绝大多数存在APC基因的突变和染色体18q的缺失，并有较高比例的KRAS和p53基因突变，好发于左半结肠，组织学类型以高、中分化为主。后者占散发性结直肠癌的15％，多见于右半结肠，组织学类型以黏液腺癌和低分化腺癌为常见，而且几乎所有的Lynch综合征相关性结直肠癌均通过MSI途径发生。更为重要的是，MSI结直肠癌不仅在好发部位、常见组织形态上与CIN结直肠癌存在差异，而且在临床预后、治疗、遗传性肿瘤筛查方案的选择上也有所不同，因此必须在临床工作中将其区分开来。本文主要就MSI结直肠癌、Lynch综合征的病理特点、发生机制、筛查策略及其临床意义做一论述。
一、DNA错配修复（mismatch repair）系统与MSI结直肠癌
错配修复系统的功能是纠正DNA复制过程出现的错误，确保复制过程的“保真性”。错配修复蛋白包括MutS和MutL两大家族，前者包括MSH2／MSH3和MSH6等，后者包括MLH1、MLH3、PMS1和PMS2。MSH2和MLH1分别与其同源错配修复蛋白组成复合体发挥作用。MSH2分别与MSH6、MSH3组成复合体MutSα、MutSβ。MLH1则分别与PMS2、PMS1或MLH3形成复合体MutLα、MutLβ或MutLγ。MutSα或MutSβ识别了错配碱基后，与DNA碱基结合，再与MutL结合，激活ATP酶，水解错配的碱基，同时激活核酸内切酶1，切除并修复错配的碱基。
微卫星（microsatellite）广泛存在于原核及真核生物基因组中，具有较高的遗传稳定性，但在错配修复基因功能发生异常时，子代细胞微卫星的重复核苷酸数量可增多或减少，导致微卫星的长度不再保持一致，这种现象称MSI。错配修复基因发生突变或启动子甲基化可引起DNA错配修复功能的降低，导致MSI。很多重要的生长调节相关基因如Ⅱ型TGF-β、IGF2R、PTEN、BAX等的编码区或启动子区含有微卫星，错配修复异常导致的MSI可引起这些基因在复制过程中发生错义突变或移码突变，这种复制错误不断累积，最终造成肿瘤的发生，而MSI则可作为经此途径发生的结直肠癌的分子标志物。
人类基因组中的微卫星位点很多，1998年MSI国际研究合作组织推荐对Bat26、Bat25、D5S346、D2S123和D17S250五个位点进行检测，根据微卫星位点不稳定的数量将结直肠癌分为高频MSI（MSI-H，具有两个或两个以上位点改变）、低频MSI（MSI-L，仅有一个位点发生改变）以及微卫星稳定型（MSS，没有位点发生改变）。由于MSI-L结直肠癌在临床表现和病理改变上与MSS肿瘤无明显差别，因此通常被归入MSS肿瘤。
约15％的结直肠癌经MSI途径发生，其中3％左右为家族遗传性（Lynch综合征），12％为散发性。
二、遗传性MSI-H结直肠癌（Lynch综合征）与散发性MSI-H结直肠癌
1、Lynch综合征与散发性MSI-H结直肠癌发生机制的异同：作为经MSI途径发生的结直肠癌的典型代表，Lynch综合征最初由Michigan大学病理系的Warthin博士于1913年最先发现并报道，至1966年Lynch医师明确了本病是一种常染色显性遗传的肿瘤综合征，在迄今100年的发现和研究过程中，“癌症家族综合征（cancer familysyndrome）”、“Lynch综合征”、“遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditary non.polyposis colorectal cancer）”等名称曾先后在不同时期被使用。随着近年来错配修复基因在本病发生中的作用逐渐明确，现在WHO肿瘤分类将Lynch综合征这一名称用于携带有错配修复基因胚系缺陷的常染色体显性遗传性肿瘤综合征。目前在Lynch综合征患者中发现的DNA错配修复缺陷包括三种类型：
（1）错配修复基因的胚系突变。这种类型占Lynch综合征的绝大多数，以MLH1、MSH2、MSH6和PMS2胚系突变为主，突变率分别为32％、38％、14％和15％，携带后两者与前两者相比癌症发生率低、发病年龄较大。
（2）上皮细胞黏附分子（EpCAM，又称肿瘤相关钙离子转导信号1）基因杂合性胚系缺失。近年的研究发现，MSH2表达丢失的Lynch综合征患者中，约5％是因位于MSH2上游的EpCAM基因3‘端外显子胚系缺失而引起的MSH2表观遗传学沉默，EpCAM胚系缺失的携带者发生结直肠癌的危险性与MSH2突变携带者相似，高于MSH6突变携带者。
（3）MLH1基因启动子胚系甲基化。有报道少数Lynch综合征家系的MLH1基因本身并未发生突变，而是因MLH1的启动子发生胚系甲基化而导致的MLH1表观沉默，但携带此类突变的家系的外显率尚待明确。与Lynch综合征不同的是，多数散发性MSI-H结直肠癌并不是由错配修复基因体细胞突变导致的，而是因MLH1基因启动子甲基化导致MLH1基因发生表观遗传学沉默所致。当2个等位基因的MLH1启动子区CpG岛均发生甲基化时，MLH1基因失活，蛋白失表达，由此导致错配修复功能异常所发生的肿瘤与Lynch综合征相关结直肠癌相似，均为MSI-H肿瘤。近期一项大宗的文献荟萃分析结果显示，63.5％的MLH1启动子甲基化或MLH1表达缺失的结直肠癌中存在BRAF基因V600E突变，而且除极个别报道外，BRAF突变几乎从不发生在Lynch综合征相关结直肠癌中，因此检测肿瘤是否存在MLH1启动子甲基化和BRAF基因V600E突变可作为区分散发性MSI-H结直肠癌与Lynch综合征相关结直肠癌的重要参数。
2、MSI-H结直肠癌的临床病理特征：Lynch综合征相关性结直肠癌与散发性MSI-H结直肠的临床病理特征大致相同。与MSS结直肠癌相比，MSI-H结直肠癌好发于右半结肠，组织学类型以黏液腺癌和低分化腺癌多见，肿瘤内有明显的上皮内淋巴细胞浸润（tumor infiltrating lymphcytes，TIL），较少见到腺腔内坏死，肿瘤边缘呈膨胀性浸润，周围可见Crohn病样淋巴细胞聚集，淋巴结转移发生率较低。相对于Lynch综合征，散发性MSI-H结直肠癌发病年龄较大，女性相对多见，更易发生在右半结肠。
尽管MSI-H结直肠癌的病理特征与MSS肿瘤存在一定差别，但除TIL外，其他形态指标的特异性和敏感性均较低，即使结合发病年龄等因素（<>
三、MSI检测的主要方法
在经济和有效的辅助检测手段缺乏的年代，形态学指标也许对筛选MSI-H结直肠癌及Lynch综合征患者有很好的提示作用，但无论从特异性、敏感性还是证据的直接性、客观性方面，形态学指标都与分子检测指标存在差距。在越来越重视客观证据的现代医疗实践中，辅助检测手段被越来越多地应用到MSI-H结直肠癌的筛查中。如前所述，MSI是MSI结直肠癌的分子特征，错配修复基因功能缺陷是MSI结直肠癌发生的分子基础，因此检测肿瘤的MSI状态和／或错配修复缺失状态是诊断MSI结直肠癌最直接的依据。
1、免疫组织化学检测错配修复蛋白：一种或多种错配修复蛋白的功能缺失可引起MSI-H，因此，检测错配修复蛋白缺失情况可间接反应肿瘤的MSI状态。错配修复蛋白在正常肠腺上皮细胞，特别是腺体基底部细胞以及淋巴细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞等间质细胞的胞核中均有表达，可作为内对照。当肿瘤细胞出现一种或几种错配修复蛋白核表达的丢失，则提示肿瘤为MSI-H。MLH1和MSH2作为错配修复复合体的共用亚单位，在发生功能缺陷时常同时伴有其同源错配修复蛋白的表达缺失。另外，如前所述，部分Lynch综合征是由于EpCAM基因胚系突变导致下游MSH2基因功能缺陷所致。Musulen等发现，在MSH2表达缺失的肿瘤中检测出EpCAM蛋白缺失，与EpCAM基因突变的吻合率达100％，所以推荐将EpCAM免疫组织化学检测加入到Lynch综合征的筛查流程中。日常工作中用于鉴别肺腺癌与恶性间皮瘤的抗体Ber-EP4即是检测EpCAM的常用克隆之一。免疫组织化学检查错配修复蛋白表达缺失的作用如下：
（1）提示哪个错配修复基因发生了功能缺失（表1）。
（2）与MLH1启动子甲基化检测和／或BRAF V600E突变检测结合，区分散发性MSI-H结直肠癌和可疑Lynch综合征患者。
（3）与EpCAM免疫组织化学检查结合，为后续的Lynch综合征遗传学突变检测提示方向。
目前，4种主要的错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均已有稳定的商品化抗体，但受组织固定、染色条件、抗体克隆号不同等因素的影响，可能会出现假阳性或假阴性结果。在判读免疫组织化学染色结果时应注意：
（1）内对照是否阳性。
（2）着色部位是否为细胞核。
（3）阳性细胞核是否为肿瘤细胞。
通常MLH1功能缺陷会合并PMS2表达缺失，而MSH2缺陷则常合并MSH6表达缺失，反之则不然。如果检测结果出现MLH1、MSH2单独缺失或MLH1／PMS2、MSH2／MSH6以外的联合表达缺失，解释结果时需格外谨慎。对免疫组织化学结果的判读绝大多数文献均采用“任何肿瘤细胞核表达即判为该错配修复蛋白阳性”的标准，但新近有文献报道发现少数MSI-H肿瘤表现为MSH6散在或小灶状表达（<>
出现这一现象的病例有两种情况，其一为病例同时存在MLH1和／或PMS2表达丢失，这是由于MSH6基因编码区内本身即有一个含8个核苷酸的微卫星重复序列，在其他错配修复蛋白功能缺陷时可继发引起MSH6基因体细胞突变而出现多数细胞失表达现象；另一种情况见于新辅助治疗后切除标本，此时其他错配修复蛋白均完整表达且术前活检标本中MSH6也完整表达，推测该现象可能与新辅助治疗导致MSH6发生继发突变或肿瘤细胞在缺氧环境下下调了MSH6的表达有关。这一现象提示：
（1）即使仍有少数肿瘤细胞（<>
（2）对于MSH6免疫组织化学染色中出现的这种特殊现象需结合临床病史和其他错配修复检测的结果判断，不可因此误导后续的胚系突变检测方向。
对错配修复蛋白免疫组织化学染色结果进行判读时，需注意：
A：内对照细胞（淋巴细胞、平滑肌细胞及正常隐窝上皮细胞）核应为阳性（MSH2）；
B：肿瘤上皮巢内浸润的淋巴细胞核阳性，注意不要误判为肿瘤细胞阳性（MLHI）；
C：某些抗体在肿瘤细胞核失表达时可H{现胞质非特异性着色（MSH6），不应误判为阳性；
D：少数MSI-H肿瘤可出现MSH6局灶性表达（MSH6） EnVision法中倍放大。
2、基于PCR的MSI检测：PCR检测MSI的原理是通过PCR方法扩增特定的微卫星序列，通过比较肿瘤组织与正常组织微卫星序列长度的差异判断是否存在MSI现象（图3）。MSI国际研究合作组织推荐检测的五个位点中Bat26、Bat25为单核苷酸重复序列，D5S346、D2S123和D17S250为双核苷酸重复序列，也有研究推荐检测更多微卫星位点。确定MSI的标准为：>30％的位点不稳定为MSI-H，10％～30％为MSI-L，<>
3、错配修复蛋白免疫组织化学检测与PCR-MSI检测的优缺点：文献报道错配修复蛋白免疫组织化学检测与PCR-MSI检测结果的符合率非常高，达97.8％，因此采用任何一种方法作为MSI-H肿瘤的筛查方法均可接受。相比之下，免疫组织化学法：
（1）简便、经济、快捷、稳定，符合病理科日常工作流程，多数基层病理科均可开展。
（2）所需组织量少，活检标本亦可检测，且检测结果与切除标本检测结果一致。
（3）可直接提示发生缺陷的错配修复蛋白类型，对于后续进行错配修复基因胚系突变检测以确诊Lynch综合征有明确的指向性。
（4）少数MSH6胚系突变病例的肿瘤由于错配修复系统的功能冗余作用可不表现为MSI，但免疫组织化学可检出蛋白表达缺失，因而可弥补PCR-MSI检测方法的局限性。PCR-MSI检测虽然相对复杂，费用相对较高，但优点是直接反映肿瘤的MSI状态，而且对于少数错义突变导致蛋白功能异常但并不影响蛋白的转录和抗原性时，免疫组织化学检测可出现假阳性，而PCR-MSI检测正好可以弥补。
四、全面检测MSI结直肠癌的必要性及推荐检测流程
区分MSI结直肠癌的临床意义包括以下三个方面。
1、提示预后：临床研究发现，在Ⅱ期结直肠癌中，MSI-H结直肠癌的比例（22％）高于Ⅲ期结直肠癌（12％），而在Ⅳ期肿瘤中仅占3.5％，提示MSI-H结直肠癌发生转移的风险较低。特别是在Ⅱ期结直肠癌患者中，MSI状态是提示预后的独立预测因子，MSI-H肿瘤预后好于MSS肿瘤。Ⅱ期结直肠癌复发的高危因素包括：肿瘤组织学类型为低分化癌、有脉管／神经侵犯、淋巴结检出数量不足12个、发生梗阻或穿孔以及切缘阳性，但如肿瘤为MSI-H型，则低分化不属高危因素。
2、指导治疗：研究发现，MSI-H结直肠癌对5-氟尿嘧啶和顺铂等化疗药物不敏感，而对伊立替康等化疗药物敏感，同时MSI结直肠癌对放疗比较敏感。美国国立综合癌症网络（NCCN）的结直肠癌临床实践指南明确指出，对MSI-H结直肠癌不宜采用5-氟尿嘧啶和铂类为主的治疗方案。
3、Lynch综合征患者筛查：Lynch综合征患者较常见同时性或异时性多发结直肠癌，如果术前能明确Lynch综合征的诊断，外科医师有可能采取更为广泛的切除术式。Lynch综合征患者不仅发生结直肠癌的风险增高，而且可以发生子宫内膜癌、卵巢癌、尿路上皮癌等多种肠外恶性肿瘤，有研究表明，阿司匹林能够预防Lynch综合征相关结直肠癌及肠外肿瘤的发生。由于Lynch综合征与大家熟知的家族性腺瘤性息肉病（FAP）不同，除非整个家族的结直肠癌发病率明显上升，否则很难发现单个个体携带者。因此，从MSI-H结直肠癌中筛选出可疑的Lynch综合征患者，不仅有利于患者本人的肿瘤治疗和预防筛查策略的制定，而且有利于发现Lynch综合征家系，为患者家族成员的肿瘤预防提供重要信息。与以往以家系调查和临床信息为主导的筛查方法比，采用分子检测等辅助手段对本病进行筛查不仅准确且更高效和可行。研究表明，如果严格按照修订的Bethesda指南进行MSI检测，将遗漏68.4％的MSI结直肠癌和14.3％的Lynch综合征。因此，EGAPP工作组（Evaluationof Genomic Applications in Practiceand Prevention Working Group）推荐对所有（或<><>
五、小结与展望
MSI结直肠癌占结直肠癌的15％，因其具有独特的发生机制、预后、治疗方案以及与Lynch综合征的密切关系而日益得到重视。目前，国际上很多大型医院和肿瘤治疗中心均已开始采取对所有新诊断的结直肠癌进行MSI和／或免疫组织化学检测的策略，有的机构甚至开始对所有新诊断的子宫内膜癌也进行全面检测。我国结直肠发病率持续上升，但对MSI肿瘤和Lynch综合征进行筛查的观念尚待普及。分子机制的研究进展和检测手段的进步，特别是免疫组织化学方法检查错配修复蛋白缺失的被认可和普及，使常规检测肿瘤MSI状态变得简便易行，而Lynch综合征筛查的主导角色更应从掌握临床信息的临床医师向掌握样本资源的病理医师转移，病理医师应责无旁贷地承担起这一责任，为患者本人及其家人尽可能地提供帮助。
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